G蛋白偶聯受體(GPCR)是人類基因組中最大、最多樣化的蛋白質家族，迄今為止已鑒定出800多個成員。它們在細胞和生理過程中發揮著重要作用，包括細胞增殖、分化、神經傳遞、發育和凋亡。GPCR位于質膜上，可識別多種不同的細胞外刺激，包括光子、離子、小分子、肽和蛋白質。其介導的信號傳導通過與不同的細胞內蛋白質（例如異源三聚體G蛋白、抑制蛋白和激酶）偶聯而發生，然后激活下游效應器并觸發細胞級聯反應。GPCR介導的信號通路與多種人類疾病有關，目前市場上30-40%的藥物都以GPCR為靶點，用于治療包括糖尿病、心臟病、腫瘤、免疫病、精神疾病等。

因此，了解GPCR的結構和功能對于研究細胞信號傳導和分子識別的基礎科學以及藥物發現的應用科學都很有價值。

一、GPCR信號傳導的雙軌機制??

圖1 GPCR調控網絡

GPCR主要通過G蛋白依賴性途徑和G蛋白非依賴性途徑啟動信號傳導。激動劑結合通過誘導構象變化來激活受體，激活的受體可以與多種細胞內信號蛋白結合，包括G蛋白、G蛋白偶聯受體激酶(GRK)和抑制蛋白(β-arrestin)等。

瑞孚迪(Revvity)提供G蛋白信號通路(cAMP、IP1)和β-arrestin蛋白信號通路的HTRF&Alpha檢測試劑。目前有6類試劑盒及一款檢測GPCR內吞的pHSense Eu探針重磅上市：

1、G蛋白依賴性通路：經典信號傳導主軸

異源三聚體G蛋白(Gα，β，γ)與GPCR的偶聯觸發核苷酸交換，隨后G蛋白解離成Gα和Gβγ亞基。GTP結合的Gα亞基可以調節腺苷酸環化酶(AC)的活性激活下游信號，而Gβγ可以與G蛋白門控內向整流鉀(GIRK)通道相互作用。G蛋白介導的信號傳導隨著GTP水解以及Gα與Gβγ重新結合形成無活性異源三聚體而終止。

Gs/Gi通路：cAMP作為信號樞紐

環磷腺苷(cAMP)是最重要的GPCR細胞內介質之一。

cAMP的生成與調控機制：

1-生成“開關”：腺苷酸環化酶(AC)

• AC是催化三磷酸腺苷(ATP)轉化為cAMP的關鍵酶。
  

• 激活途徑：Gαs亞基激活AC，促使細胞內cAMP增加。
  

• 抑制途徑：Gαi亞基抑制AC活性，導致cAMP減少。
  

2-降解“剎車”：磷酸二酯酶(PDE)

PDE會將cAMP降解為AMP，降低信號強度。當細胞內加入一定濃度的IBMX（PDE抑制劑），可引起cAMP的積聚。所以通過測定cAMP的含量，可以用于評估Gαi/s通路的激活程度。

Gq通路：IP1作為通路激活指標

脂酰肌醇級聯反應：

• 當細胞外的信號分子與Gαq受體結合后，激活細胞膜上的磷脂酶C(PLC-β)；

• PLC-β水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)為肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)；

• IP1是IP3的轉化產物之一，IP3的半衰期很短，其產生后在磷酸酶的作用下生成IP2，然后生成IP1，終產物為myo-肌醇；

• LiCl能夠阻止IP1轉化為myo-肌醇，當細胞內加入一定濃度的LiCl，可引起IP1的積聚。所以通過測定IP1的含量，可以用于評估Gαq通路的激活程度。

Gi結合測定：GTP交換的實時監測

HTRFGTPGi結合測定原理：

激動劑刺激GPCR誘導Gαi亞基處的GDP/GTP核苷酸交換，Eu-GTP取代與Gα結合的GDP。Gαi則通過添加d2標記的抗Gαi抗體進行檢測。當Eu和d2靠近并在酶標儀激發時，它們之間會產生熒光共振能量轉移，直接反映GTP和Gαi的結合。

圖2 G蛋白信號通路的HTRF&Alpha檢測試劑

2、G蛋白非依賴性通路

β-arrestin介導的內吞

β-arrestin是一種多功能信號蛋白，在許多生理和病理過程中發揮著重要作用，包括脫敏、內化和隔離以及GPCR的運輸。

β-arrestin1、2是GPCR脫敏和內化的介質，廣泛分布于各種組織和細胞中。

由于β-arrestin能夠抑制廣泛的G蛋白信號并激活更直接的傳導級聯，因此開發β-arrestin相關藥物比通常的GPCR靶點藥物更不易產生副作用。

圖3 β-arrestin蛋白信號通路的HTRF檢測試劑

不依賴β-arrestin介導的內吞

越來越多的研究發現GPCR內吞不僅僅只依賴于β-arrestin，還可能通過其他方式介導內吞。pHSense Eu探針可輕松實現GPCR內化過程的動態全景監測，為GPCR類藥物開發提供了從分子機制到臨床轉化的關鍵評估工具。

圖4 pHSense Eu探針

二、Tag-lite?技術：配體結合研究的革新方案??

1、構建標記細胞

• 將SNAP與目標GPCR“綁定”成共轉染質粒，后轉染細胞，得到共表達SNAP和目標GPCR的細胞；

• 加入結合了Tb穴狀化合物（以下簡稱Tb）的SNAP底物，SNAP與底物不可逆共價結合，可牢牢將Tb標記在GPCR細胞上。

2、受體配體結合實驗：HTRF信號生成

• 加入d2標記的配體，當它與GPCR結合時，Tb和d2接近，產生HTRF信號；
  

• 若測試化合物與d2配體“爭搶”受體，會導致HTRF信號降低。

圖5 受配體結合研究試劑

三、磷酸化蛋白檢測??

圖6 部分磷酸化蛋白檢測產品（HTRF/Alpha胞內磷酸化/總蛋白檢測試劑盒）