Western Blot——樣品制備篇

樣品制備的目的是從細胞或其他樣品中提取和溶解蛋白，去除污染物并將總蛋白濃度調節至合適的上樣范圍，主要涉及以下步驟和操作：

細胞裂解是指蛋白釋放到溶液中的過程。不同的生物材料，從不同細胞結構分離蛋白，需要不同的裂解方法。應使用適當的化學抑制劑并控制溫度，最大限度地降低蛋白酶和其他降解或修飾蛋白的酶活性。

要想成功的進行PAGE電泳，必須首先將蛋白溶解到緩沖體系中。可使用含有變性劑、去污劑、還原劑、緩沖劑以及電泳體系兼容的增溶溶液。通過加入抑制劑并保持樣品低溫，防止蛋白被降解或修飾。

上樣前，需要通過蛋白測定法確定樣品中蛋白質的濃度，調整濃度以進行電泳分離。過高的上樣量會導致凝膠過載，過低的上樣量會導致條帶信號過弱。

在Western Blot實驗中，我們常常遇到不同類型樣品需要進行蛋白的釋放，如培養的哺乳動物細胞、植物細胞、組織、酵母、細菌等。下面，我們介紹幾種常見的細胞裂解方法。

除垢劑劑可以溶解易破裂的細胞，如血細胞或組織培養細胞。NP-40等非離子型除垢劑溫和且不變性，但溶解疏水蛋白能力較低。兩性離子除垢劑(如CHAPS)和離子除垢劑(如SDS)可有效增加蛋白溶解性，并使蛋白變性。

使用勻漿器、超聲波儀或組織研磨使細胞受力破碎。超聲處理等方法會產生熱量，從而使樣品過熱，因此，需使用冷卻方法以避免樣品過熱。例如，在超聲處理期間，可將樣品浸入冰浴；使用研缽和研杵研磨樣品時，需添加液氮保持樣品低溫。通常會同時使用化學破碎法和機械法來最大限度釋放樣品中的蛋白質。

使用可消化植物或細菌細胞壁的酶對細胞進行裂解處理。例如，纖維素酶和果膠酶(植物細胞)、裂解酶(酵母細胞)溶菌酶(細菌)。酶處理之后通常會再使用另一種破碎方法繼續處理，如超聲。

小技巧：無論采用何種細胞破碎方法，均應除去所有不溶物，以免堵塞凝膠孔洞，上樣前離心（15℃下20000xg，持續15分鐘）。