數字PCR定量分析技術是通過將DNA分子分配到獨立的反應室，并在每個反應室中進行PCR擴增反應后，對陽性熒光信號進行檢測，實現DNA分子的定量。數字PCR技術擺脫了對標準曲線的依賴，具有更高靈敏度和準確度，是繼實時定量PCR之后新興發展起來的一種絕對定量分析技術。在基因突變檢測、拷貝數變異檢測、微生物檢測等方面有著廣泛應用前景。

理想狀況下，ddPCR（Droplet digital PCR）可檢測到0.01%的突變。以Bio-Rad QX200數字PCR為例，理論情況下可生成20,000個微滴，當突變頻率＜0.01%時，理論上陽性微滴可能只有0-2個，統計的不確定性極大。考慮增加液滴數量，在數學上是可行的，但設備復雜度和成本都可能隨之增加。因此如何進一步提高數字PCR檢測低頻突變的靈敏度是精準醫學和液體活檢領域的重要研究方向。以下介紹幾種可行的方法。

游離DNA（cfDNA，包括循環腫瘤DNA ctDNA）的濃度是影響數字PCR檢測靈敏度的關鍵因素之一。首先可增加血漿輸入量（如 4–10 mL血漿），對于超低濃度樣本（如早期癌癥），可嘗試多管合并提取以提高檢出率。其次對于已抽提好的低濃度cfDNA我們可以采取濃縮方式提高樣本濃度，從而提高上樣量。濃縮的方式有多種，比如用純化試劑盒重新純化后減少洗脫體積，也可以使用濃縮儀直接濃縮，但濃縮方式對于樣本濃度的提升是有限的。同時要注意的是，純化試劑盒可能會造成目標模板的丟失，濃縮儀會使樣本整體的純度變差，因此無限制的濃縮反而會造成后續PCR擴增抑制，進而影響低頻檢測。

鎖核酸探針（Locked Nucleic Acid, LNA）是一種通過化學修飾的核酸類似物，其獨特的結構賦予其在分子檢測中顯著的優勢，尤其在提高靈敏度、特異性和穩定性方面表現突出。LNA探針可顯著擴大完全匹配與錯配序列的Tm值差異（ΔTm >15℃），精準識別SNP（單核苷酸多態性）和低頻突變（如腫瘤cfDNA 、ctDNA中的0.01%突變）。在qPCR或數字PCR中，LNA探針的非特異性結合減少，信噪比提高。故在檢測體系中引入LNA探針可在一定程度上提高低頻突變的檢出。

 通過富集模板即在線性范圍內同比例富集突變和野生型，用富集模板做ddPCR，從而避免了由于樣本中的DNA片段的含量過低，低于數字PCR最低檢測水平，從而造成假陰性的檢測結果。

通常情況下，數字PCR的單孔反應總體系一般在20uL，單孔生成的微滴總數介于10000-20000之間，限制了單個孔的檢測樣本總拷貝數在10萬拷貝以內（可根據基因組大小與樣本總質量換算）。面對十萬分之一以下的低頻突變的檢測（那么意味著待測樣本的總質量超出了單孔檢測的上限），除了上述提到的方法，可采取的另外一種檢測和分析策略是將待測樣本均分成幾個等份（保證每孔樣本投入量不超過單孔上限），分成幾個反應孔同時進行數字PCR檢測，最終將同一樣本對應的反應孔的數據疊加查看，也可以得到更低豐度的突變檢出。

除了上述四種方法外，還有減少背景干擾，例如選擇性去除野生型DNA、CRISPR-Cas9 靶向切割野生型DNA、利用sgDNase（一種精準的DNA分子剪切工具）特異性去除基因組中的高背景野生型鏈等方法。但此類方案通常處理復雜且成本較高，不利于常規使用。

提高低頻檢出，本質上就是提高低豐度樣本的擴增效率，跟聚合酶的擴增效率、引物探針的擴增效率（在保證特異性的前提下）、檢測樣本的純度和上樣總量都相關。沒有完美和一勞永逸的方案，在充分考慮可操作性、成本等多種因素的前提下，希望能為大家目前遇到的實驗困境帶了一些靈感。后續會持續推出我們在實踐過程中的一些感悟心得，歡迎大家批評指正。綜上，盡管數字PCR在檢測低頻突變方面還有提升的空間，但目前仍是液體活檢中認可度最高的技術手段之一。

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